مقدمه

انگور (L. Vitis vinifera) یکی از محصولات مهم باغی در ایران بشمار می رود (بهداد 1366،  بنی هاشمی و پروین 1374) بطوریکه در سال زراعی 1388-1387 سطح زیر کشت انگور در ایران حدود 315000 هکتار و با میزان تولید 2710000 تن محصول بوده است. مناطق عمده تولید انگور در ایران عبارتند از: استان های فارس، خراسان، قزوین، آذربایجان شرقی و غربی، همدان و اردبیل که استان اردبیل با 2500 هکتار سطح زیر کشت و تولید 22500 تن محصول، مقام هیجدهم را در کشور به خود اختصاص داده است (بی نام 1388). بیماری سفیدک سطحی انگور یکی از بیماری های مهم در تاکستان ها بوده و در اکثر مناطق انگور کاری دنیا وجود دارد (دین و گرای 2008، فرنکل و همکاران 2010 و گادوری و همکاران2011 و 2012). این بیماری در صورت فراهم شدن شرایط محیطی مناسب بیش از هر بیماری دیگر به انگور خسارت وارد کرده و موجب کاهش محصول، کاهش کیفیت میوه، حساسیت به بیماری کپک خاکستری و افزایش هزینه تولید را سبب می شود. اعتقاد بر این است که قارچ عامل بیماری     E. necatorبومی آمریکای شمالی بوده و در سال 1845 از اروپا گزارش و سپس سریعاً در سایر قاره ها انتشار یافته و خسارت زیادی را به بار می آورد (بهداد 1366، بابای اهری و هوشنگی 1373، گاودری و همکاران 2001، هالن و هولز 2001،  واین و ویلکوکس 2003، کاریس و همکاران 2006 و دین و گرای 2008). بیماری سفیدک سطحی انگور در ایران ابتدا در سال 1325 گزارش شده است. این بیماری در تمام نقاط انگورکاری ایران وجود داشته و در بعضی سال ها خسارت آن 60 – 55 درصد برآورد گردیده است (بهداد 1366). قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور  می­تواند تمام قسمت های سبز درخت انگور را مورد حمله قرار دهد (هالن و هولز 2001، فرنکل و همکاران 2010 و گادوری و همکاران 2011). زمستان گذرانی قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور به شکل میسلیوم در جوانه های در حال خواب انگور به عنوان شکل اصلی زمستان گذرانی در اغلب نواحی انگورکاری دنیا به اثبات رسیده است (بهداد 1366، پیرسون و گادوری 1987 و گادوری و پیرسون 1990). علی رغم اینکه اغلب محققین بر این عقیده هستند که زمستان گذرانی قارچ عامل بیماری به صورت میسیلیوم در جوانه های در حال خواب انگور انجام می شود و مرحله جنسی قارچ نقشی در بقا ندارد (پیرسون و گادوری 1987، گادوری و پیرسون 1990 و  فرنکل و همکاران 2010) اما برخی از محققین بقای آن را به صورت مرحله جنسی ذکر نموده اند (هالن و هولز 2001). علاوه بر آن، نتایج تحقیقات انجام یافته در تاکستان های ایتالیا نشان داد که بیشترین درصد زنده ماندن کلیستوتسیوم روی پوست گیاه انگور بوده و در خاک هیچ گونه کلیستوتسیوم زنده یافت نشد (کورتسی و همکاران 1997). برانلی و همکاران (2004) گزارش کردند که قارچ E. necator دارای دو بیوتیپ بوده و این قارچ می تواند به دو حالت کلیستوتسیوم و میسلیوم زمستان گذرانی کند. دین و گرای (2008) گزارش کردند که نحوه زمستان گذرانی E. necator مشخص نبوده و ممکن است زمستان گذرانی قارچ  به صورت میسلیوم و یا آسکوکارپ باشد. بر اساس مطالعات انجام شده در نیویورک میسلیوم قارچ E. necator درجوانه های در حال خواب انگور پیدا نشد اما آسکوسپورهای این قارچ بوسیلة اسپورگیرهای حجمی بعد از باز شدن جوانه ها از تاکستان ها جمع آوری گردید. در این ایالت اولین کلنی های بیماری سفیدک سطحی انگور در روی     برگ ها زمانی که اندازه شا خه ها 30-7 سانتی متر بودند مشاهده شدند. بررسی های انجام یافته در زمینه شروع، توسعه، پراکندگی و بقای آسکوکارپ های قارچ عامل بیماری E. necator نشان داد که حدود 100- 95 درصد آسکوکارپ های تشکیل شده در سطح اندام های انگور در طی زمستان از بین رفتند و هیچ آسکوکارپ زنده ای از برگ های پوسیده به دست  نیامد (پیرسون و گادوری 1987). بر اساس تحقیقات انجام یافته دمای مورد نیاز جهت جوانه زنی کنیدی ها ی قارچ عامل بیماری 6 درجه سلسیوس و دمای مناسب 25 درجه سلسیوس بوده و در دمای بالاتر از 31 درجه سلسیوس رشد قارچ کند و در دمای بالاتر از 35 درجه سلسیوس رشد میسلیوم ها متوقف می‌گردد (دلپ 1954). بنی هاشمی و پروین (1374) برای اولین بار از استان فارس وجود کلیستوتسیوم های قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور را گزارش کرده اند هر چند که در اغلب نقاط انگورکاری ایران کلیستوتسیوم ها روی برگ های مسن و شاخه های انگور به فراوانی تشکیل می شود اما نقش آنها در اپیدمی بیماری کاملا ً مشخص نیست. در مناطق  مختلف مشگین شهر منبع تلقیح اولیه برای شروع اپیدمی های سفیدک سطحی انگور مشخص نیست ولی از اوایل مهر ماه تا آبان ماه تعداد زیادی کلیستوتسیوم این قارچ روی برگ ها و شاخه های انگور تشکیل می شوند. این تحقیق به منظور بررسی چگونگی زمستان گذرانی قارچ عامل بیماری و زمان بروز آلودگی های اولیه و ثانویه با توجه به شرایط اقلیمی و فنولوژی انگور در مشگین شهر انجام گرفت. مراحل مختلف فنولوژیکی گیاه انگور شامل     1- خواب زمستانی 3- مرحله کرک دار شدن جوانه ها 5- شکفتگی جوانه ها 7-ظهور اولین برگ 12- مرحله 6-5 برگی 15- دراز شدن گل آذین 19- آغاز گل دهی 23- مرحله کامل گل دهی 27- تشکیل میوه 29- مرحله حبه کوچک 31- آویزان شدن خوشه ها 33- آغاز تماس حبه ها با یکدیگر 35- آغاز رسیدن حبه 38- برداشت حبه ها و 43- خزان برگ ها است (آیشهورن و لورنس 1977).

مواد و روش ها

1- بررسی پراکنش عامل بیماری

به منظور بررسی وضعیت پراکنش بیماری در منطقه مورد مطالعه، در فاصله بین سال های 87 تا 89 تاکستان های شهرستان مشگین شهر از ابتدای فروردین ماه تا اواخر آبان ماه بطور مرتب مورد بررسی قرار گرفتند. در این بازدیدها برگ ها، خوشه ها و شاخه های آلوده انگور جمع آوری و در درون   کیسه های پلاستیکی به آزمایشگاه منتقل گردید. در آزمایشگاه به کمک بینوکلر هر دو سطح برگ ها و تمام سطوح شاخه ها بررسی و سپس از نمونه ها لام های میکروسکوپی لازم تهیه و مورد مطاله قرار گرفت. ارقام عمده انگور کاشته شده در این باغات ارقام کشمشی، رسمی و شاهانی از گونه  Vitis vinifera L. بودند.

2- تعیین زمان خروج و پراکنش کنیدی ها و آسکوسپورها

از نیمه اول اسفند ماه تا اواخر شهریور ماه       سال های مورد مطالعه و به منظور مشاهده زمان خروج و پخش اسپورها در منطقه تعداد 20 عدد پایه چوبی به ارتفاع 25،50، 75 و 100 سانتی متر در پنج نقطه باغ مورد آزمایش در بین ردیف های انگور ارقام کشمشی و رسمی که بصورت پاچراغی کاشته شده بودند نصب گردید و روی هر پایه در سطوح بالایی، زیری و کناری پنج عدد لام آغشته به وازلین چسبانده شد. لام ها هر چهار روز یکبار تعویض و به آزمایشگاه منتقل و در آنجا دو خط میانی به فواصل 7/0 میلی متر در سراسر قسمت میانی لام ها کشیده و با محلول  کاتن بلو- لاکتوفنل رنگ آمیزی و تعداد اسپورها در زیر میکروسکوپ با بزرگ نمایی x10 شمارش و ثبت گردید (گی و همکاران 2000). برای تعیین رابطه بین       کنیدی زایی قارچ و تغییرات شرایط جوی، آمار هواشناسی منطقه مرتباً از ایستگاه هواشناسی    مشگین شهر دریافت و میانگین حرارت و رطوبت نسبی مربوط به هر چهار روزی که لام ها روی پایه قرار داشتند محاسبه می شد.

3- بررسی جوانه های در حال خواب انگور به منظور مشخص نمودن وجود یا عدم وجود میسلیوم قارچ عامل بیماری در درون جوانه ها

از اوایل فروردین ماه سال های 1389- 1387 در مرحله فنولوژی 1 و 3 انگور از جوانه های در حال خواب موجود روی شاخه ها نمونه برداری و جهت مشخصنمودن وجود یا عدم وجود میسلیوم در درون جوانه ها با استفاده از روش نومووا (1972) عملیات تثبیت، قالب گیری، برش میکروتومی و رنگ آمیزی روی نمونه ها انجام گرفت. به منظور تثبیت نمونه ها از تثبیت کننده فرمالین- اسید استیک- الکل FAA) ) استفاده گردید. نمونه های مورد آزمایش بمدت 24 ساعت در این فیکساتیو نگهداری شد. برای آبگیری نمونه ها از تکنیک جابجایی فاز مایع با الکل استفاده شد (سری بوتیل الکل نوع سوم با غلظت های 70، 85، 95 و 100 درصد).  جهت آغشته سازی و قالب گیری     نمونه ها، پارافین مذاب مورد استفاده قرار گرفت.   نمونه های آغشته شده در داخل قالب پر از پارافین قرار داده شدند و ضمن انجماد پارافین، نمونه ها نیز در داخل آن باقی مانده و آماده مقطع گیری گردیدند.  نمونه ها همراه با قالب پارافینی توسط دستگاه میکروتوم دوار به ضخامت 20- 15 میکرومتر برش داده شدند. به منظور چسباندن برش های تهیه شده روی لام ها از ژلاتین استفاده گردید. جهت حذف پارافین از نمونه ها، اسلایدها در دو نوبت در زایلول خالص و پس از آن در حجم مساوی از زایلول و اتانول مطلق به مدت 5 دقیقه قرار داده شدند. نهایتاً نمونه ها جهت آبدهی به سری الکل اتیلیک 95، 85 و70 درصد منتقل و سپس نمونه های آماده شده بوسیله محلول کاتن بلو- لاکتوفنل رنگ آمیزی و با استفاده از میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند.

4- قابلیت بقای کلیستوتسیوم ها در طول فصل

آسکوکارپ های موجود در سطح برگ ها و     شاخه های آلوده از مهر ماه سال های 1389- 1387 تا اردیبهشت ماه با استفاده از روش کورتسی و همکاران (1997) هر ماه یک بار جمع آوری شدند. هر بار 50 عدد آسکوکارپ به صورت منفرد روی لام میکروسکوپ منتقل شده و قابلیت زنده ماندن آنها در محلول 01/0 درصد فلوئورسین دی استات در آب بعد از 5 دقیقه تحت میکروسکوپ فلوئورسانس بر اساس روش گی و همکاران (2000) بررسی شد. آسکوکارپ هایی زنده محسوب شدند که 50% آسکوسپورهای آن رنگ سبز روشن فلوئورسانس را نشان دهند.

5- بررسی بیماری زایی آسکوسپورها

در طی سال های 1389- 1387 برای اثبات    بیماری زایی آسکوسپورهای قارچ عامل بیماری نخست برگ های انگور ارقام کشمشی و رسمی که به ابعاد تشتک پتری با قطر 9 سانتی متر بودند انتخاب و به مدت 5 دقیقه با محلول هیپوکلریت سدیم 1% ضد عفونی شدند. برگ های فوق از محل دم برگ در داخل یک تشتک پتری محتوی 25 میلی لیتر محیط آب- آگار 5/1 درصد همراه با 100 قسمت در میلیون بنزیمیدازول که قبلا ًدر سطح آن چهار خلال چوب کبریت استریل به منظور ایجاد فاصله بین برگ و سطح محیط کشت تعبیه شده بود فرو برده شد در درب هر تشتک پتری نیز دو برگ کاغذ صافی استریل تعبیه و با 2 میلی لیتر آب استریل خیس گردید. سپس چهار دیسک کاغذی که روی هر یک 20 عدد کلیستوتسیوم قارچ عامل بیماری قرار داده شده بود روی کاغذ صافی موجود در درب تشتک پتری گذاشته شد و پایه ثشتک پتری به صورت وارونه روی آن قرار گرفت و با پارافیلم به منظور حفظ رطوبت مسدود شد. سپس تشتک های پتری در ژرمیناتور با دمای 25 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی100% که 4 عدد لامپ فلورسنت با شدت نور 2000 لوکس نیز در آن روشن بود قرار داده و بعد از 10 روز تشتک های پتری از درون ژرمیناتور خارج و وجود و یا عدم وجود کلنی های قارچ عامل بیماری    E. necator روی برگ های بریده انگور بررسی شد (اوانتس 1996).

6- بررسی تأثیر دما روی جوانه زنی کنیدی های عامل بیماری

برای تعیین زمان شروع و حداکثر جوانه زنی  کنیدی ها، تعیین درصد جوانه زنی کنیدی ها در دماهای مختلف و همچنین تعیین دمای مناسب برای  جوانه زنی کنیدی ابتدا رطوبت نسبی ژرمیناتور روی 100%  و با شدت نور 2000 لوکس تنظیم شد. روی لام ها حدود 400 عدد کنیدی قرار داده شد و در دامنه دمایی 34-7 درجه سلسیوس و با فواصل 3 درجه سلسیوس آزمایش شدند. هر تیمار در 4 تکرار انجام گرفت. پس از گذشت 2 ساعت از شروع قرار دادن لام های میکروسکوپی کنیدی های جوانه زده روی هر لام شمارش و دوباره به ژرمیناتور منتقل شد سپس هر 4 ساعت یک بار تا حداکثر 34 ساعت این عمل ادامه داشت (اسپنسر 1978).

7- بررسی تأثیر رطوبت نسبی روی جوانه زنی کنیدی ها

تاثیر رطوبت های نسبی 10، 20، 40، 60، 80 و 100 درصد روی جوانه زنی کنیدی ها در ژرمیناتور با دمای 25 درجه سلسیوس با 4 لامپ فلورسنت روشن (2000 لوکس) مورد بررسی قرار گرفت. برای هر رطوبت نسبی 4 لام میکروسکوپی انتخاب و روی هر لام 400 عدد کنیدی قرار داده شد و پس از گذشت 34 ساعت تعداد کنیدی های جوانه زده روی هر لام شمارش و ثبت شد (اسپنسر 1978).

8- بررسی اثر نور روی جوانه زنی کنیدی ها

برای این منظور در کف 4 عدد تشتک های پتری چند لایه کاغذ صافی قرار داده و به کمک پیست کاملاً مرطوب گردید سپس 2 عدد چوب کبریت روی       کاغذ های صافی مرطوب قرار داده و یک عدد لام میکروسکوپی حاوی 400 عدد کنیدی طوری روی چوب ها قرار داده شد که با کاغذ صافی مرطوب تماس نداشته باشد. سپس هر یک از تشتک های پتری درون یک اتاقک تاریک مقوایی به ابعاد 10×10×20 سانتی متر قرار گرفت و در ژرمیناتور با دمای 25 درجه سلسیوس به مدت 34 ساعت نگهداری شد و هم زمان با آن 4 عدد لام که هر یک حاوی 400 عدد کنیدی بود به مدت 34 ساعت در ژرمیناتور با شرایط دمای 25 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 100% که 4 عدد لامپ فلورسنت (2000 لوکس ) نیز در آن روشن بود قرار داده و پس از 34 ساعت لام ها از درون ژرمیناتور خارج و با میکروسکوپ نوری کنیدی های جوانه زده شمارش گردید (اسپنسر 1978).

نتایج

علایم بیماری سفیدک سطحی انگور در سرشاخه ها و جوانه های برگی جوان انگور در اوایل فصل رشد رویشی مشاهده نگردید. علایم این بیماری در هنگام ظهور به صورت توده ریسه ای سفید رنگ در سطح رویی برگ ها و اغلب در حاشیه برگ های شاخه های جانبی جوان به طول30- 7 سانتی متر از اواخر خرداد ماه قابل رویت بود. مطالعه سیر پیشرفت بیماری با توجه به مراحل فنولوژیک گیاه انگور نشان داد که در سال های 1389- 1387 نخستین نشانه های بیماری سفیدک سطحی انگور در مرحله فنولوژی 27 و 29 (مرحله تشکیل میوه و حبه کوچک) به صورت لکه های کوچک رنگ پریده روی برگ ها مشاهده و در اوایل تیر ماه (میانگین دما 5/21 درجه سلسیوس و میانگین رطوبت نسبی 52%) با آغاز تورم حبه ها، کنیدی های قارچ روی  لکه های آلوده ظاهر گردیدند. در طول زمان با مساعد شدن دما، تعداد لکه ها روی برگ ها افزایش قابل توجهی نشان داد و در زمان رسیدن حبه ها و در اوایل  شهریور ماه شدت بیماری روی برگ های مسن و خوشه های آلوده به 100  درصد رسید (میانگین دما 2/23 درجه سلسیوس و میانگین رطوبت نسبی 57%). تولید کنیدی در قارچ عامل بیماری تا 27 شهریور ماه ادامه داشته و سپس متوقف گردید (میانگین دما 6/12  درجه سلسیوس و میانگین رطوبت نسبی 65%).

بررسی های انجام یافته در طی سه سال نشان داد که در محدوده زمانی 6-1 خرداد ماه (متوسط دما     6/ 17 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 3/58%) در مرحله فنولوژی 12 و 15 انگور (مراحل 5 تا 6 برگی و دراز شدن گل آذین ها) نخستین کنیدی های قارچ عامل بیماری E. nectaor در روی لام های تله ای مشاهده و اولین نشانه های بیماری روی برگ ها بین 28-26 خرداد ماه رویت گردید. بیشترین کنیدی زایی و شکار کنیدی ها در محدوده زمانی 28 تیر تا 28 مرداد ماه اتفاق افتاد (متوسط دما 7/22 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 9/53%). از اوائل شهریور ماه        کنیدی زایی قارچ عامل بیماری کاهش یافت بطوری که از 26 شهریور ماه به بعد هیچ کنیدی در لام های      تله ای پیدا نشد. بتدریج از اوایل  مهر ماه در روی  برگ ها و خوشه های انگور آسکوکارپ های قارچ عامل بیماری ظاهر گردیدند (متوسط دما 35/12 درجه سلسیوس و رطوبت  نسبی  69%). اولین آسکوکارپ قارچ در تاریخ 10/7/1387، 12/7/1388 و 13/7/1389 به ترتیب 107، 109 و 110 روز بعد از پیدایش علائم بیماری بر روی برگ ها و حبه ها ی انگور دیده شدند (شکل 1). نتایج بررسی های سه ساله در تاکستان های مشگین شهر نشان داد که کلیه کلیستوتسیوم های قارچ عامل بیماری E. nectaor در طی زمستان از بین رفتند و در بهار هیچ آسکوکارپ زنده ای از نمونه های    برگ های پوسیده انگور بدست نیامد. همچنین    بیماری زایی آسکوسپورها روی برگ های بریده انگور که با کلیستوتسیوم های داخل کیسه های نگهداری شده در باغ مایه زنی شده بودند به اثبات نرسید.   بدین ترتیب نقش کلیستوتسیوم ها در زمستان گذرانی و بیماری زایی قارچ عامل بیماری رد شد.

 نتایج بررسی جوانه های انگور در طی سه سال در تاکستان های مشگین شهر بیانگر آن است که قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور به صورت میسلیوم  غیر فعال در درون جوانه های آلوده و در حال خواب انگور زمستان گذرانی می کند که با مطالعات دقیق هیستوپاتولوژیکی وجود میسلیوم در درون جوانه های دورمانت و نقش آنها در بیماری زایی و اپیدمیولوژی قارچ  E. nectaorبه اثبات رسید (شکل 2).

نتایج بررسی اثر شرایط محیطی روی جوانه زنی کنیدی های E. nectaor در ژرمیناتور نشان داد که جوانه زنی کنیدی ها در دمای کمتر از 10 درجه سلسیوس بسیار جزئی و بیشترین جوانه زنی     کنیدی ها در دمای 25 درجه سلسیوس و رطوبت های نسبی 100- 40 درصد اتفاق می افتد. این رطوبت ها تقریباً تأًثیر یکسانی روی جوانه زنی کنیدی ها داشته جوانه زنی کنیدی ها با افزایش دما از 25 به 33 درجه سلسیوس کاهش و جوانه زنی آنها در دمای بالاتر از 34 درجه سلسیوس بطور کامل متوقف گردید (جدول 1 و 2 ). در این بررسی ها میزان جوانه زنی کنیدی های قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور در حضور نور ضعیف و پیوسته تقریباٌ دو برابر میزان جوانه زنی آنها در تاریکی مطلق بود.

                                                      شکل 1-  کلیستوتسیوم های قارچ   E. necatorروی                 شکل 2-  میسلیوم های قارچ  E. necator در درون جوانه آلوده برگ آلوده انگور.                                                                       و در حال خواب انگور.

جدول 1-  درصد جوانه زنی کنیدی های قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگور در دماهای مختلف، رطوبت نسبی 100% و نور فلورسنت 2000 لوکس پس از 34 ساعت.

جدول 2-  اثر رطوبت نسبی روی جوانه زنی کنیدی های قارچ عامل بیماری سفیدک سطحی انگوردر دمای 25 درجه سلسیوس و نور فلورسنت 2000  لوکس  پس از 34 ساعت.