بررسی کنترل بیولوژیکی علف هرز تلخه (Acroptilon repens L.) به وسیله عوامل بیماری زای قارچی

مقدمه

در میان تمامی آفت کش های شیمیایی، علف­کش­ها بیشترین میزان مصرف را در کل دنیا به خود اختصاص داده اند که این مطلب روشن گر اهمیت نسبی علف­های هرز می باشد (کویمبی و همکاران 2002). استفاده مداوم از یک علف­کش و یا علف­کش­هایی با نحوه عمل یکسان علاوه بر پدید آمدن جمعیت مقاوم علف­های هرز به علف­کش­ها، آلودگی های زیست محیطی را نیز در پی دارد (هانگ و گرسل 1997). نگرانی ها در مورد عملیات رایج کنترل علف­های هرز، اهمیت توجه به راهکارهای نوین مدیریت از جمله کنترل بیولوژیکی را افزایش داده است (راشدمحصل و حسینی 1386).  کنترل بیولوژیکی علف­های هرز روشی است که در آن اصول اکولوژیکی و زیستی به خوبی رعایت می شوند. در این روش از دشمنان طبیعی و عوامل بیماریزا (حشرات، قارچ ها، ویروس ها، باکتری ها و نماتدها) به منظور کاهش جمعیت، توانایی رقابت و میزان خسارت علف­هرز به زیر سطح آستانه خسارت اقتصادی استفاده می شود (مندی 2001).  استفاده از عوامل بیماری زای گیاهی برای مدیریت علف­های هرز در سیستم های کشاورزی و مراتع به عنوان روشی کاربردی، ایمن، مناسب برای محیط زیست مورد قبول واقع شده است (چاروداتان 2001).

تلخه (Acroptilon repens L.) علف هرزی مخرب است که معمولا از طریق جوانه های موجود در ریشه های خزنده و بذر تکثیر شده و پس از استقرار در یک محیط، می تواند پوششی یکپارچه و وسیع تشکیل داده و جایگزین سایر گونه های گیاهی شود (کلین 2011). این گیاه ممکن است تا 70 سال دوام داشته باشد (آرملینا و زیمدال 1998). تلخه علاوه بر آنکه در زمین های زراعی  باعث کاهش عملکرد  محصول می شود،  به طور قابل  توجهی از ارزش و کیفیت خاک نیز می کاهد (واتسون 1980). حضور آن در گیاهان علوفه ای بسیار مشکل ساز است. کیفیت آرد و سایر محصولات غلات و حبوبات که به وسیله تلخه آلوده شده باشند به خاطر مزه تلخ آن کاهش می یابند. این گیاه با هجوم به رستنگاه های بومی مانع رشد سایر گیاهان گشته و تنوع زیستی را کاهش می دهد (USDA 2008). کنترل این گیاه به خاطر داشتن  ریزوم و توانایی رشد رویشی فوق العاده و نفوذ ریشه ها به عمق خاک بسیار مشکل می باشد. بخشی از خسارت تلخه همچنین به ترشح مواد آللوپاتیک نسبت داده می شود (میلر و هیلد 2006).

این علف هرز بومی ایران، آسیای صغیر، ارمنستان، ترکیه، ترکمنستان و مغولستان می باشد و هم اکنون در بسیاری از نقاط دنیا به چشم می خورد (جاکوبس و دنی 2006). طبق بررسی نوروزاده و همکاران (1387) علف­های هرز خارشتر (Alhagi psendoalhagi) و تلخه با بیش از 47 در صد حضور در مناطق مختلف استان های خراسان شمالی، جنوبی و رضوی، مهمترین علف­های هرز چند ساله می باشند. همچنین این گیاه هرز با شاخص غالبیت حدود 57 درصد  به عنوان مهمترین رستنی مزاحم قبل از برداشت گندم در شهرستان کرج گزارش شده است (مین باشی معینی و همکاران 1387). کنترل شیمیایی گیاه هرز تلخه علاوه بر پی آمد­های اکولوژیکی اغلب در مراتع مقرون به صرفه نیست. روش های مکانیکی نیز تاثیر محدودی بر سیستم ریشه ای گسترده تلخه دارد و می تواند تاثیرات مخربی بر گیاهان غیر هدف داشته باشد (جانسون 2008). سایر روش ها نیز گران و موقتی خوانده شده اند (وگرپیج 2009). لذا یافتن عوامل کنترل بیولوژیکی موثر و کارآمد از اهمیت زیادیبرخوردار است. تلخه در سال 1992 در آمریکا به عنوان علف هرز هدف برای کنترل بیولوژیک کلاسیک معرفی شد (کویمبی 1995). همچنین این گیاه به عنوان یکی از ده گونه از مهم ترین علف­های هرز در کانادا و امریکا، از اولویت های کنترل زیستی معرفی شده است (اسکینر و همکاران 2000).

تا کنون اقدامات متعددی در سایر کشور ها برای یافتن عوامل بیماری زای مناسب برای کنترل بیولوژیکی تلخه انجام شده است. اولین تلاش ها از سال 1970 آغاز، و به رها سازی گونه ای نماتد  گالزا با نام Subanguina picridisمنجر شد (واتسون 1977). بررسی­های آزمایشگاهی خسارت شدید این نماتد بر رشد گیاه و تولید بذور نشان داده اما به دلیل تحرک کم و شرایط رطوبتی متفاوت نتایج رهاسازی کمتر از حد انتظار بود (جانسون 2008). قارچ Phoma exigua var exigua (PEE)  از جمله عوامل بیماری زای گزارش شده از روی این گیاه است که در ترکیه به عنوان قارچی با پتانسیل کنترل بیولوژیکی تلخه معرفی گردید (برنر و همکاران 2011). گونه Cercosporella acroptili قارچ دیگری است که در ترکیه، قزاقستان و قرقیزستان یافت شده و کاربرد آن سبب بروز بیماری در تمامی برگ­های پایینی گیاه تلخه شده است (برنر و همکاران 2005). اسپور­های این قارچ می­تواند به عنوان عامل تقویت کننده در فرمولاسیون علف­کش  PEE به کار روند تا کارایی آن را بر تلخه افزایش دهند (برنر و همکاران 2011).  زنگ   Pucciniaacroptiliپارازیت کننده تلخه و بومی آسیا و اروپا ست و در شمال آمریکا نیز گسترش دارد. طبیعت تک میزبانه این قارچ گواه این است که
 P. acroptiliدارای میزبان اختصاصی است که این خصوصیت برای عوامل بیماریزایی که در کنترل بیولوژیک علف هرز به کار می روند ضروری است (بروکارت وهمکاران 2010).

تراکم عامل بیماری و دوره رطوبت اشباع از مهمترین شرایط برای کارایی عوامل کنترل میکروبی علف­های هرز می باشد. به بیان دیگر برای گسترش بیماری در علف هرز هدف، میزان کافی از اندام های تولید مثلی (اسپورها،کنیدی ها، قطعات میسیلیویی) برای کنترل  بیولوژیکی در سطح گیاه مورد نیاز است. به علاوه اسپورها یا میسیلیوم ها و سلول های بیشتر عوامل بیماریزا برای تندش، نفوذ و آلودگی در میزبان، به یک دوره ای که در آن یک لایه آب یا رطوبت آزاد روی بافت­های برگ را پوشیده باشد، نیاز دارند که این رطوبت در طبیعت از طریق ایجاد شبنم تامین می گردد و معمولا هر چه طول دوره وقوع شبنم بیشتر باشد بیماری زایی افزایش می یابد (قربانی و همکاران 2005).

چون علف هرز تلخه بومی ایران می­باشد، پژوهش حاضر به منظور جمع­آوری و شناسایی عوامل بیماری­زا­ی موجود روی تلخه و ارزیابی آن­ها به منظور بررسی امکان کنترل بیولوژیک این علف هرز به عنوان روشی مناسب و مبتنی بر اصول اکولوژیک انجام شده است.

مواد و روش ها

تهیه و پرورش بوته های تلخه

این تحقیق در استان خراسان رضوی، روستای کلاته شیخها در جلگه چناران واقع در شهرستان چناران به انجام رسید.  با توجه به این که تلخه معمولا از طریق جوانه های موجود بر ریشه­های خزنده و به ندرت از طریق بذر تکثیر می یابد، ریشه های تلخه در اسفند ماه 1390 از داخل خاک جمع آوری و در دمای 10 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. در فروردین ماه 1391 قطعاتی به طول 20 سانتی متر و قطر تقریبا یکسان که دارای دو تا سه جوانه بوده از بین ریشه­ها انتخاب گردید (آل ابراهیم و همکاران 1388) و در گلدان هایی به قطر 20 و ارتفاع 20 سانتی­متر که حاوی مخلوطی از خاک زراعی و ماسه بودند به حالت افقی و در عمق چهار سانتی متری خاک کشت شدند. در هر گلدان دو قطعه  از ریشه­ها قرار داده شد. پس از جوانه زدن و روییدن بوته­ها در سطح خاک، تنها یک بوته را در هر گلدان نگه داشته و بقیه بوته­ها حذف شدند.

نمونه برداری و خالص سازی عوامل بیمارگر

گیاهان تلخه دارای علائم آلودگی به عوامل بیماری زا طی 20 بار نمونه برداری از رویشگاه های طبیعی تلخه و کشتزار­های آلوده به آن در چناران و مشهد جمع­آوری گشتند. نمونه­ها بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شده و با استفاده از قیچی سترون به قطعات کوچک دو تا سه میلی متری تقسیم شدند. جهت ضدعفونی سطحی، آن ها را در محلول هیپوکلریت سدیم[1] 1 درصد به مدت 30 تا 45 ثانیه قرار داده و آنگاهسه بار در آب مقطر سترون  به مدت یک دقیقه شستشو داده شد. سپس با قرار دادن آنها بر روی کاغذ صافی سترون، رطوبت همراه آنها گرفته شد و داخل پتری دیش های حاوی محیط کشت PDA کشت داده شدند.

پس از آنکه پر گنه های[2] قارچی به حد کافی رشد یافت، جهت خالص سازی مقدماتی از هر یک از آن ها کشت فرعی[3] تهیه گردید. سپس با استفاده از روش تک اسپور در محیط آب-آگار، مرحله نهایی خالص سازی انجام شد و بسته به نوع قارچ به محیط برگ میخک -آگار یا PDA انتقال یافت. بدین ترتیب پرگنه های خالص سازی شده که شامل یک جدایه فوزاریوم و شش جدایه آلترناریا بود، برای مراحل بعدی این پژوهش نگهداری شدند. با توجه به آنکه یکی از عوامل جمع آوری شده از روی تلخه از قارچ های عامل زنگ و پارازیت اجباری بود. به منظور خالص سازی، ابتدا قطعات برگ و ساقه جمع آوری شده حاوی زنگ به روش فوق ضد عفونی گردیدند. سپس مایه زنی اولیه بر روی برگ های ظریف گیاهچه های تلخه که تنها چهار هفته از زمان کاشت آنها گذشته بود صورت گرفت. روی گلدان ها پوشش نایلونی سیاه رنگ کشیده و با پاشش آب درون فضای میان گیاه و روکش پلاستیکی، رطوبت گلدان ها افزایش داده شد و به مدت 48 ساعت در دمای 20 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس گلدان ها به گلخانه با دمای 25 درجه سانتی گراد انتقال یافت. چون احتمال وجود چند نژاد زنگ  در یک نمونه وجود داشت، به منظور خالص سازی یکی از جوش ها که به طور جداگانه قرار گرفته بود با قلم موی ظریف ( شماره سه صفر) برداشته شد و روی گیاهچه تلخه مایه زنی گردید. جوش هایی که در این مرحله به دست آمدند در چند مرحله تکثیر و اسپور زیادی حاصل گشت (قاسم زاده و همکاران،1389 و بروکارت و همکاران، 2010).

تهیه مایه قارچ جهت مایه زنی

برای تهیه مایه قارچ فوزاریوم از کشت پنج روزه این جدایه در محیط PDA بلوکی به ابعاد پنج میلی متر به ویال های حاوی محیط کشت مایع PDB منتقل گردید و به مدت سه روز بر روی دستگاه شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه در آزمایشگاه با دمای 2± 24 درجه سانتیگراد به هم زده شد. به منظور تهیه سوسپانسیون اسپور و حذف میسیلیوم ها و مواد زاید، محتویات هر کدام از ویال ها از پارچه ململ سترون عبور داده شد. ضمنا 5/0 درصد توئین 20[4] به عنوان ماده پخش کننده به سوسپانسیوت اسپور هر جدایه اضافه گردید.

برای تهیه مایه تلقیح جدایه های آلترناریا، از هر جدایه چند پتری کشت خالص روی محیط PDA تهیه شد. سپس 5-10 میلی لیتر محلول رقیق شده توئین 20 در هر پتری حاوی قارچ ریخته و با لوپ استریل سطح قارچ ها به آرامی خراش دهی شد و اسپور ها جداسازی گردیدند. سپس مخلوط بدست آمده از پارچه ململ استریل عبور داده شد. جهت تولید مایه تلقیح زنگ، اسپورها با استفاده از قلم موی ظریف (شماره سه صفر) از سطح برگ برداشته شده و در محلول آب مقطر و توئین 20 (0.15%  v/v ­) معلق گردیدند (بروکارت و همکاران، 2010). شمارش اسپورها با کمک لام هموسایتومتر انجام شد.

تعیین توان بیماری زایی جدایه ها روی برگ بریده و گیاهچه تلخه

با توجه به این که تعداد جدایه های استخراج شده زیاد بود ابتدا توان بیماری زایی آنها روی برگ بریده تلخه در آزمایشگاه بررسی گردید تا قوی ترین عوامل بیماری زای قارچی انتخاب شوند و در آزمایش های بعدی به کار روند. ابتدا برگ های جوان گیاهان تلخه که فاقد هر گونه علایم بیماری بودند، داخل پتری دیش هایی به قطر دهانه 10 سانتی متر دارای کاغذ صافی سترون مرطوب قرار داده شدند. سپس برگ ها به وسیله سوزن سترون خراشدهی شده  و با استفاده از سمپلر روی قسمت های خراشدهی شده یک قطره سوسپانسیون به غلظت 10⁷×1 اسپور در میلی­لیتر قرار گرفت. پتری دیش ها به مدت 10 روز زیر پوشش پلاستیکی در دمای 25 درجه سانتی گراد در رطوبت بالاتر از 70 درصد قرار گرفتند. پتری دیش ها روزانه بازدید شده و هر گونه علایم بیماری ثبت شد.

 در مرحله بعد، پس از گذشت چهار هفته از کاشت ریشه های تلخه و هنگامی که در مرحله گیاهچه بودند، سوسپانسیون حاوی اسپور با غلظت 10⁷ اسپور در یک میلی لیتر بر روی آنها پاشیده شد. گلدان ها در گلخانه ای با دمای 30- 25 درجه سانتیگراد و رطوبت 60 در صد قرارگرفتند. این دما و رطوبت تا پایان آزمایش ثابت نگه داشته شد. به منظور ایجاد رطوبت کافی جهت فعالیت قارچ ها، گلدان ها به مدت 48 ساعت پس از پاشش سوسپانسیون، به وسیله پوشش پلاستیکی پوشانده شدند. تا دو هفته پس از ظهور اولین علایم، گلدان ها به صورت روزانه بازدید گشتند، و مقدار آلودگی روی آن ها ثبت شد. در هر دو آزمایش در تیمارهای شاهد از آب مقطر سترون به همراه 5/0 درصد توئین 20 بدون اندام های قارچی استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار صورت گرفت.  ارزیابی میزان بیماری زایی گیاهان تیمار شده بر اساس روش نمره دهی صفر تا پنج انجام شد. سیستم نمره دهی بدین صورت بود که صفر= عدم بیماری، 1= 25-1 درصد آلودگی ، 2= 50-26 درصد آلودگی، 3= 75-51 درصد آلودگی، 4= 97-75 درصد و 5= 99 درصد آلودگی یا مرگ گیاه (فلاح پور 1389) را نشان می دهد. همچنین تعیین و مقایسه وزن خشک گیاهچه های تیمارها، معیار دیگری برای ارزیابی تاثیر آ،نها بود. برای تعیین وزن خشک، گیاهچه ها پس از قرار داده شدن در آون 72 درجه سانتی گراد برای 48 ساعت توزین شدند.

شناسایی نمونه ها

پس از پایان آزمایش های مقدماتی، جدایه های برتر، مجدداً جداسازی و خالص سازی شده و با نمونه های اولیه مورد مقایسه قرار گرفتند. شناسایی جدایه ها تا سطح گونه در گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد.

تعیین دامنه میزبانی

در این مرحله  10 گیاه  از مهمترین گیاهان اقتصادی منطقه به منظور تست دامنه میزبانی قارچ های مورد نظر انتخاب شدند. این گیاهان شامل گندم^[5] رقم سایونز، جو^[6] رقم سهند، جو رقم سی بی، کلزا^[7] رقم اکاپی به عنوان مهمترین گیاهان زراعی پاییزه و گوجه فرنگی^[8] رقم های موبیل و استنلی، چغندر قند^[9] رقم ناگانو، خیار^[10] رقم بینگو، ،لوبیا^[11] رقم سانرایز، ذرت^[12] رقم 704 مغان و سیب زمینی^[13]رقم فونتان به عنوان محصولات رایج کشت بهاره و یونجه^[14] رقم سکوئل به عنوان یک محصول زراعی چند ساله بودند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی در 4 تکرار در دو مرحله آزمایشگاهی و گلخانه ای صورت گرفت.  ابتدا برگ های جوان گیاهان زراعی ذکر شده که فاقد هرگونه آلودگی بودند جدا شده و پس از ضد عفونی سطحی، داخل پتری دیش هایی به قطر دهانه 10 سانتیمتر دارای کاغذ صافی سترون مرطوب در کف آن ها قرار گرفتند (هر کاغذ صافی با سه قطره آب مرطوب شده بود). سپس برگ ها خراشدهی شدند و روی قسمت های خراشیده یک قطره سوسپانسیون با غلظت 10⁷×1 اسپور در میلی­لیتر قرار گرفت. پتری ها به مدت 10 روز زیر پوشش پلاستیکی در دمای 25 درجه سانتی گراد و در رطوبت نسبی 90 درصد قرار گرفتند. پتری دیش ها روزانه بازدید شده و هر گونه علایم بیماری ثبت شد.

در آزمایش گلخانه ای، سوسپانسیون حاوی اسپورهای قارچ های مورد نظر با غلظت 10⁷×1 اسپور در میلی­لیتر بر روی گیاهان زراعی رشد داده شده در گلدان هایی به قطر دهانه 18 و عمق  15 سانتی متر که با مخلوطی از خاک زراعی و ماسه پرشده بودند، محلول پاشی گشتند و در گلخانه ای با دمای 30- 25 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 60 در صد قرار داده شدند.  گلدان ها به مدت 48 ساعت پس از استفاده از سوسپانسیون به وسیله پوشش پلاستیکی شفاف برای آلترناریا و فوزاریومو پوشش تیره  برای پوکسینیا محصور گشتند.

بررسی اثر بیماری زایی غلظت های مختلف  اسپور قارچ

برای تعیین بهترین غلظت سوسپانسیون اسپور های قارچ در بروز علائم بیماری بر روی تلخه، آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام گرفت. در این آزمایش اثر چهار غلظت 10⁷، 10⁶،10⁵ و10⁴ اسپور در میلی لیتر آب مقطر بر روی بوته های تلخه در دمای 25 درجه سانتی گراد و رطوبت اشباع برای 48 ساعت پس از اسپور پاشی مورد بررسی قرار گرفت. شمارش اسپورها با استفاده از لام هموسایتومتر صورت گرفت تا غلظت مورد نظر سوسپانسیون بدست آید. در صورتی که غلظت سوسپانسیون بیش از میزان مورد نظر بود با استفاده از آب مقطر استریل آن را رقیق کرده تا به غلظت دلخواه برسد. اما اگر غلظت کمتر از حد مطلوب بود با قرار گرفتن در دستگاه سانتریفیوژ با 2000 دور در ثانیه به مدت دو دقیقه، غلظت مناسب حاصل می شد.

گیاهان تیمار شده به مدت یک ماه مورد بازدید و بررسی قرار گرفتند و ارزیابی نهایی با استفاده از اندازه گیری وزن خشک انجام شد. به علاوه با محاسبه سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC^[15])، روند توسعه آلودگی در طول زمان برای هر تیمار بر اساس فرمول زیر( حاجیان فر و زربخش، 1389 و شپرز و همکاران، 2009). تعیین گردی:

AUDPC = S_i=1^n-1 [(X_i + X_i+1)(t_i+1 – t_i)/2]

در این معادله، Xi  درصد آلودگی به بیماری در مشاهده اول، Xi+1 در صد آلودگی به بیماری در مشاهده دوم، ti زمان یادداشت برداری در مشاهده اول، ti+1  زمان یادداشت برداری در مشاهده دوم، n تعداد کل مشاهدات بود.

stAUDPC^[16] نیز از طریق تقسیم مقدار AUDPC بر تعداد روز های بین شروع اپیدمی و پایان آن محاسبه شد.

stAUDPC = AUDPC/ duration of epidemic

بررسی اثر رطوبت اشباع و نوع پوشش پلاستیکی روی بیماری زایی

این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد. تیمارها در این آزمایش پوشش پلاستیکی در دو سطح (تیره و شفاف) و

دوره های زمانی مختلف رطوبت پس از اسپور پاشی در شش سطح (3، 6، 12، 18، 24، 48 ساعت) بودند. به این منظور بهترین غلظت سوسپانسیون اسپور تعیین شده در ایجاد علائم روی تلخه اعمال شد. بلافاصله بعد از مایه زنی بوته ها با  قارچ، روی گلدان ها با پوشش پلاستیکی پوشانده شد و  پیش از محصور کردن گلدان ها توسط این پوشش با پاشیدن آب درون فضای میان گیاه و روکش پلاستیکی، رطوبت زیر پوشش پلاستیکی هرگلدان  افزایش یافت و رطوبت آن به بالای 80 در صد رسید. پس از سپری شدن مدت دوره های رطوبتی، گلدان ها به گلخانه با دمای حدود 25 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی حدود 60 درصد منتقل شدند. سپس معیار وزن خشک و محاسبه سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تراکم تاول های حاوی اسپور های زنگ با محاسبه تعداد تاول در هر سانتی متر مربع برگ تلخه تخمین زده شد.

محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل

جهت انجام محاسبات آماری، از نرم افزار SAS ver.9.1 استفاده شد (شابانا و همکاران 2010). میانگین­ها  با استفاده از آزمون چند دامنه ای دانکن درسطح احتمال 1 درصد مورد مقایسه آماری قرار گرفتند. نمره بیماری کسب شده در رابطه با هر یک از تیمار ها با استفاده از آزمون غیر پارامتری کروسکال-والیس[17] (سوکال و رولف 1992) و نرم افزار MINITAB ver.13.1 (سوکال و رولف 1992) مورد مقایسه قرار گرفت. رسم نمودارها با استفاده از نرم افزارExcel 2007 انجام شد.

نتایج و بحث

از نمونه های تلخه آلوده جمع آوری شده، جمعا شش جدایه از قارچ آلترناریاAlternaria alternata (A1, A2, A3, A4, A5,A6) و یک جدایه فوزاریوم Fusarium oxysporum (F) و یک جدایه پوکسینیا Puccinia acroptili (P) خالص سازی شد. سپس این جدایه ها برای سنجش کنترل بیولوژیک علف هرز تلخه مورد بررسی قرار گرفتند.

تعیین توان بیماری زایی جدایه ها روی برگ بریده تلخه

در این مرحله تمامی تیمارها با شاهد در سطح 1 درصد اختلاف معنی دار داشتند (01/0 >P و 6/28=H). بیشترین بیماری زایی بر اساس مقیاس نمره دهی، مربوط به جدایه F (F. oxysporum) و جدایه A1 (A. alternata) بود که با دیگر تیمارها اختلاف معنی داری نشان دادند (شکل 1). چون زنگ (P. acroptili) پارازیت اجباری است، لذا این مورد در مراحل اولیه تنها  با  مایه زنی گیاهچه های جوان مورد آزمون قرار گرفت.       

شکل 1- مقایسه  توان بیماری زایی جدایه های استخراج شده روی برگ بریده تلخه در آزمایشگاه. هر میانگین حاصل چهار تکرار بوده و حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی دار میانگین ها در سطح احتمال 1 درصد بر اساس آزمون کروسکال-والیس می باشد. A1 تا A6= جدایه های مختلف آلترناریا، F = جدایه فوزاریوم و C   = شاهد می باشند.

تعیین توان بیماری زایی جدایه ها روی گیاهچه تلخه

کلیه تیمارها با شاهد در سطح یک درصد، اختلاف معنی دار داشتند (01/0>P و 07/31H=). بیشترین بیماری زایی مربوط به جدایه های F (F. oxysporum) و A1 (A. alternata) ارزیابی شد. همان طور که در شکل2 ملاحظه می شود نمره بیماری جدایه A1 و F با دیگر جدایه ها  دارای اختلاف معنی_­داری
می­باشد.

کمترین وزن خشک بوته های تلخه مربوط به جدایه فوزاریوم (F) و آلترناریا (A1) بود که به ترتیب آن را تا 75% و 76% کاهش دادند. جدایه های پوکسینیا (P) و آلترناریا A2)) نیز توانستند به ترتیب 61 و 58 درصد، وزن  خشک  را نسبت به شاهد کاهش دهند (شکل 3).

جدایه قارچ فوزاریوم پس از مایه­زنی با سوسپانسیون اسپور با غلظت 10⁷×1 اسپور در میلی لیتر، روی برگ های تلخه علایمی به صورت لکه های نکروزه در محل مایه زنی ایجاد نمود که به تدریج توسعه یافته و به قسمت های بالا و پایین محل اولیه کشیده شد. هر شش جدایه آلترناریا ابتدا باعث پدیدار شدن لکه های سیاه رنگ و سپس گسترش آلودگی به تمام سطح برگ و در نهایت مرگ گیاهچه گشتند. علایم جدایه زنگ ابتدا به صورت لکه های کوچک و رنگ پریده  بدون اسپورزایی بود. سپس ظهور تاول ها و اسپورزایی فراوان همراه با کلروز در اندام های هوایی گیاه (ساقه و برگ) رخ داد. در حالی که در شاهد که با آب مقطر سترون به همراه 5/0 درصد توئین 20 مایه زنی شده بودند هیچ گونه علایمی مشاهده نشد. با توجه به آزمون های تعیین توان بیماری زایی جدایه ها در آزمایشگاه و در مرحله گیاهچه، جدایه هایF(F. oxysporum)، A1(A. alternata) وP  )  (P. acroptiliبه منظور ادامه آزمایش ها برگزیده شدند.           

تعیین دامنه میزبانی

  نتایج آزمون دامنه میزبانی در آزمایشگاه و گلخانه نشان داد که مایه زنی با سوسپانسیون اسپور  A. alternata با غلظت 10⁷ اسپور در میلی لیتر روی کلزا و سیب زمینی و F. oxysporum با همین غلظت روی گندم، جو، سیب زمینی و ذرت منجر به ایجاد بیماری شدند (جدول 1). ولی مایه زنی P.  acroptiliدر هیچ یک از گیاهان مورد آزمایش منجر به بروز علائمی نشد (جدول 1).

با توجه به این که  جدایه P.  acroptili در گیاهچه تلخه بیماری زا تشخیص داده شد و از طرف دیگر تهدیدی برای گیاهان زراعی آزمایش شده نیست  می تواند به عنوان یک عامل کنترل بیولوژیک مورد بررسی بیشتر قرار گیرد.

جدول 1- دامنه میزبانی قارچ های استخراج شده از روی تلخه بر رویمهمترین گیاهان اقتصادی در منطقه

بررسی اثر غلظت های مختلف قارچP. acroptiliدر بیماریزایی روی تلخه

با افزایش غلظت اسپورهای این قارچ تا 10⁷ اسپور در میلی لیتر آب مقطر ، وزن خشک تلخه به شدت کاهش یافت که دلیل آن می تواند افزایش توان آلوده سازی قارچ و اختلال در فتوسنتز و سیستم سوخت وساز تلخه باشد. شکل های 4 و 5 نشان می دهند که غلظت 10⁷ اسپور در یک  میلی لیتر آب با افزایش سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری تا 62/24 درصد و 40 درصد کاهش وزن خشک گیاه هرز تلخه نسبت به شاهد، موثرترین تیمار می باشد. در حالی که تفاوت معنی داری بین شاهد و تیمارهای غلظت های 10⁵ و 10⁴ اسپور در میلی لیتر وجود نداشته است (01/0P <).

شکل 5- اثر غلظت های مختلفacroptili  Pucciniaبر وزن خشک هر گیاه هرز تلخه.

هر میانگین حاصل 4 تکرار بوده و حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی دار میانگین ها بر اساس آزمون دانکن در سطح %1 می باشند.

تاثیر طول دوره شبنم بر بیماری زایی Puccinia acroptili روی گیاه هرز تلخه

به طور  کلی وزن خشک گیاه تلخه در تیمار نقطه شبنم 48 ساعت و 24 ساعت با پلاستیک تیره اختلاف معنی داری با  یکدیگر و با سایر تیمارها داشتند. کمترین وزن خشک 727/0 گرم، مربوط به تیمار دوره رطوبتی 48 ساعته و پوشش پلاستیک تیره بوده که نسبت به وزن خشک تیمار دوره 3 ساعته با پوشش روشن 40 درصد کمتر ارزیابی شد.

 نتایج حاکی از آن است که برای بروز علایم بیماری و ایجاد آلودگی جدایه زنگ حداقل به 24 ساعت رطوبت اشباع نیاز است. در این آزمایش تیمار 48 ساعت با پوشش تیره رنگ به وضوح روند توسعه بیماری را بیشتر نمود. تیمارهای 48 و 24 ساعت تیره با یکدیگر و با سایر تیمارها  در سطح  یک در صد تفاوت معنی داری داشتند (شکل 7). طبق مشاهدات گلخانه ای تیمارهایی که در آن ها تاریکی اعمال شده بود، اسپورزایی بیشتری داشتند. این در حالی است که علائم در گلدان هایی که در طی دوره رطوبتی به وسیله پلاستیک روشن محصور شده بودند، عمدتا فقط شامل لکه های کلروتیک و نکروتیک بوند. همچنین شکل 8 نیز نشان می دهد که بیشترین تراکم جوش های حاوی اسپور در تیمار 48 ساعت با پوشش تیره می باشد. لذا این طور به نظر می رسد که اعمال تاریکی به همراه 48 ساعت نقطه شبنم شرایط مساعدتری را در گیاه برای تکثیر ورخنه جدایه زنگ (P. acroptili )  روی علف هرز تلخه فراهم می کند.

شکل6- تاثیر طول دوره نقطه شبنم بر وزن خشک هر گیاه تلخه به وسیلهacroptili  Puccinia.

هر میانگین حاصل 4 تکرار بوده و حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی دار میانگین ها  بر اساس آزمون دانکن در سطح 1% می باشند.

شکل 7- تاثیر طول دوره نقطه شبنم بر سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری acroptiliPuccinia.

هر میانگین حاصل 4 تکرار بوده و حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی دار میانگین ها  بر اساس آزمون دانکن در سطح 1% می باشند.

شکل8- تاثیر طول دوره نقطه شبنم بر تراکم تاول هایacroptili  Puccinia.

هر میانگین حاصل 4 تکرار بوده و حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی دار میانگین ها  بر اساس آزمون دانکن در سطح 1% می باشند.